主流的化学发光试剂中磁珠是一项重要的试剂，磁分离技术也是一项开创先河的技术。磁分离技术的使用使得试剂的检测准确度、灵敏度、线性范围都有着很大程度的提升。下面简单介绍一下化学发光试剂中常用的羧基磁珠试剂的制备工艺。

羧基磁珠表面含有丰富的羧基基团，由于没有活性所以无法直接与蛋白连接，需要用活化剂进行活化，而磁珠试剂制备的工艺根据活化剂添加的先后顺序分为一步法和两步法。

一、一步法偶联步骤

（1）磁珠清洗：取10mg磁珠，加入1mL活化液清洗三次，并加入1mL的活化液。

注意：

①此步骤主要是除去磁珠原液，防止磁珠原液中存在影响反应的成分；

②活化液pH5.0至7.0之间，不同项目的pH需要进行优化以达到最优结果。

（2）抗体吸附：取10ug~30ug/mg磁珠的抗体，加入到磁珠液中，旋涡混匀，然后置于摇床中混匀30min-60min，反应温度25℃-35℃。

注意：

①此步骤主要是让抗体和微球接近，让抗体附着在磁珠表面；

②加入抗体后要迅速震荡。

（3）偶联反应：向磁珠液中加入5ug~30ug/mg磁珠的活化剂，旋涡混匀，然后置于摇床中混匀1h-3h，反应温度25℃-35℃。

（4）封闭：向磁珠溶液中加入一定量的封闭剂，如BSA、酪蛋白、或者其他商业封闭剂旋涡混匀，然后置于摇床中混匀30min~60min，反应温度25℃-35℃。

（5）清洗保存：用pH7.0左右的清洗液进行清洗3次，用1mL的pH8.0左右的保存液保存。

一步法偶联中常用的活化液有MES、硼酸、HEPPS等，常用的活化剂就是经典的EDC了，清洗液和保存液可以选择Tris、磷酸盐等pH合适的缓冲液。

二、两步法偶联步骤

（1）磁珠清洗：取10mg磁珠，加入磁珠清洗：取10mg磁珠，加入1mL活化液清洗三次，并加入1mL的活化液。

（2）磁珠活化：加入5ug~30ug/mg磁珠的活化剂，旋涡混匀，然后置于摇床中混匀20~30min，反应温度25℃-35℃。

（3）磁珠清洗：将活化后的磁珠进行磁分离，并用偶联液进行清洗2次，加入1mL的偶联液，旋涡混匀。

（4）抗体偶联：在磁珠液中加入10ug~30ug/mg磁珠的抗体，旋涡混匀，然后置于摇床中混匀2h-3h，反应温度25℃-35℃。

（5）封闭：向磁珠溶液中加入一定量的封闭剂，如BSA、酪蛋白、或者其他商业封闭剂旋涡混匀，然后置于摇床中混匀30min~60min，反应温度25℃-35℃。

（6）磁珠清洗：用pH7.0左右的清洗液进行清洗3次，用1mL的pH8.0左右的保存液保存。

两步法偶联中，活化后的磁珠清洗步骤在活化剂控制得当的条件时可以省略，但是对工艺控制要求比较高；同时两步法活化液与偶联液通常不一样，需要进行交叉实验进行优化。

羧基磁珠的偶联在常规类型的磁珠偶联工艺中，算是比较简单的工艺过程中，后续将会陆续介绍其他基团磁珠偶联抗体的工艺。

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